细菌DNA特征序列鉴定法-中国药典2020版四部通则1021

　细菌DNA特征序列鉴定法系以特征核酸序列作为目标检测物，用于药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等药品全生命周期质量控制中细菌的鉴定。

　　本法通过对细菌16S核糖体RNA(16S  ribosomal  RNA gene，16S  rRNA)基因特征序列的测定，实现细菌的生物学鉴定。细菌16S rRNA基因全长约1500bp，包含9个可变区(VarIable  region，V区)和10个恒定区(Constant  region，C区)，在结构与功能上具有高度保守性，是细菌分类和鉴定中得到广泛应用的DNA特征序列之一。　

　　实验环境和仪器的一般要求

　　开展细菌鉴定试验的环境应具备分子生物学实验室的基本条件，并符合相应级别的生物安全要求。

　　所用仪器有电子天平、离心机、冰箱、恒温仪、DNA定量仪器(如紫外或荧光分光光度仪)，聚合酶链式反应(polymerase  chain  reaction，PCR)分析仪、电泳仪、凝胶成像仪、核酸测序仪等。　　

　　试剂及其制备方法　　

　　三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠缓冲液(TE缓冲液，pH8.0)  称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，加适量水搅拌溶解，并稀释至100ml，用盐酸试液调节pH值至8.0，得到1mol/L贮备液；称取乙二胺四乙酸二钠18.6g，加适量水搅拌溶解，并稀释至100ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0，得到0.5mol/L贮备液。取三羟甲基氨基甲烷贮备液10ml，乙二胺四乙酸二钠贮备液2ml，加水稀释至1000ml，灭菌。

　　PCR反应缓冲液(pH8.3)  称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，氯化钾37.3g，氯化镁2.4g，加适量水搅拌溶解，并稀释至1000ml，用盐酸试液调节pH值至8.3，灭菌。

　　电泳缓冲液(TAE缓冲液，pH8.0)  称取三羟甲基氨基甲烷4.84g，冰乙酸1.14ml，乙二胺四乙酸二钠0.75g，加适量水搅拌溶解，并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0。

　　上样缓冲液  称取溴溴酚蓝0.25g，二甲苯氰0.25g，蔗糖40.0g，加适量水搅拌溶解，并稀释至100ml。

　　核酸的提取、扩增、产物检测和纯化等也可以采用适宜的商品化试剂和试剂盒。　

　　方法适用性试验　　

　　细菌DNA特征序列鉴定时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于目标菌的鉴定。若鉴定条件发生变化可能影响鉴定结果时，应重新进行方法适用性试验。

　　进行方法适用性试验时，选择革兰阳性和阴性标准菌株按“待检菌的测定”步骤进行操作。提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求；核酸扩增产物应能在500bp左右检测到一条目的条带；核酸测序结果应与相应对照菌株的核酸序列一致。

　　方法适用性试验应设定阴性对照试验，取灭菌的纯化水作为阴性对照，照核酸提取及后续步骤进行操作。核酸扩增产物应无扩增条带。

　　方法适用性试验可与待检菌的测定同时进行。　　

　　待检菌的测定　　

　　待检菌的测定应设置阳性对照试验和阴性对照试验。

　　阳性对照试验

　　根据待检菌的革兰染色等特性，选择特征序列确定的菌株作为阳性对照菌，照待检菌的测定步骤进行操作。阳性对照试验提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求；核酸扩增产物应能在500bp左右检测到一条目的条带；核酸测序结果应与相应对照菌株的核酸序列一致。

　　阴性对照试验

　　取灭菌的纯化水作为阴性对照，照核酸提取及后续步骤进行操作，用以确证核酸提取、PCR反应体系和扩增过程无污染。阴性对照试验的核酸扩增产物应无扩增条带。

　　待检菌测定

　　(1)分离纯化   挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线培养，以获取纯培养物(单个菌落)。

　　(2)核酸提取   核酸提取常用十六烷基三甲溴化铵(cetyltrimethylammonium  bromide  method，CTAB)法，也可采用十二烷基硫酸钠法、碱裂解法等其他适宜的方法，必要时加入核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)去除RNA。

　　CTAB法提取核酸的一般步骤   取适量经分离纯化后的

　　待测菌纯培养物于离心管中，加入TE缓冲液450μl、溶菌酶(10mg/ml)25μl，混匀，置37℃水浴加热30分钟；加入10%十二烷基硫酸钠溶液50μl，混匀，置37℃水浴加热15分钟；加入1%氯化钠溶液80μl、10%CTAB溶液70μl，混匀，置65℃水浴加热15分钟；加入饱和苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25：24：1，ml/m1)溶液350μl，剧烈振荡，室温静置5分钟，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入2倍体积无水乙醇，于-20℃静置不少于30分钟，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液；加入适量75%乙醇溶液洗涤，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜体积的TE缓冲液溶解，作为核酸提取溶液(模板DNA)，置2～8℃冰箱中备用。

　　待检菌提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求，核酸浓度宜不低于10ng/μl。模板DNA浓度和纯度测定常用紫外分光光度法，A260/A280比值宜在1.8～2.0之间。

　　(3)核酸扩增  本法中的核酸扩增是指对16S rRNA基因VI～V3可变区核酸序列片段进行扩增，其扩增引物、反应体系及扩增程序如下：

　　扩增引物  正向引物(16SV1F):5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3'；

　　反向引物(16SV3R)：5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'。

　　反应体系  常用的PCR反应体系为25μl。制备时，取PCR反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸(2.5mmol/L)2μl，正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl，模板DNA 1μl，Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl，加灭菌的纯化水至25μl。

　　扩增程序  采用的扩增程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃继续延伸5分钟。

　　(4)核酸扩増产物的检测  采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物。使用电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶，其中加入溴化乙锭或吖啶橙等适宜的核酸凝胶染色剂。取核酸扩增产物5μl、上样缓冲液1μl，混匀后上样，于100～150V电压下电泳，溴酚蓝条带移动至凝胶片的1/2～2/3处结束电泳。取凝胶片在紫外凝胶成像仪上检视，核酸扩增产物应在约500bp的位置出现一条目的条带。核酸扩增产物检测时应选择适宜的DNA分子量标记，目的条带的大小应包括在DNA分子量标记的范围内。

　　(5)核酸扩增产物的纯化  核酸扩增产物应进行纯化，去除扩增引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶等残留。核酸扩增产物纯化的主要步骤包括：将琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入适量体积的TE缓冲液，65～95℃水浴至凝胶块完全溶解；分别加入1/10体积乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和乙二胺四乙酸钠溶液(125mmol/L，pH8.0)，混匀；加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置30分钟；离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液；加入适量75%乙醇溶液洗涤，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜体积的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置2～8℃冰箱中备用。

　　(6)核酸测序 以扩增引物作为测序引物，使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序，获得目标核酸序列。对核酸测序结果进行序列质量核查。双向测序峰图应采用有峰图拼接功能的软件，以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接，并去除两端引物区序列。拼接后得到的核酸序列方向应与核酸扩增正向引物方向一致。

　　(7)结果判定  将获得的细菌DNA特征序列与经验证过的专用数据库进行比对。根据比对结果进行判定。